مطالعه و شناسایی سویه¬های باکتریایی تولیدکننده کوتیناز- قسمت ۱۳- قسمت 2

مراحل استخراج DNA با بهره گرفتن از روش CTAB
۱- ابتدا محیط کشت مایع نوترینت براس تهیه شده و سویه­ها را در آن تلقیح نموده و در شیکر انکوباتور با ۱۰۰rpm و دمای ۳۰ درجه سانتی گراد به مدت ۲۴ ساعت قرار داده تا باکتری­ ها به میزان کافی رشد نمایند.
۲- سپس ۵/۱ میلی لیتر از محیط کشت حاوی باکتری را در میکروتیوب ریخته و با ۱۰۰۰۰rpm به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق سانتریفوژ می­ شود( این مرحله ۳ بار تکرار می شود).
۳- مایع رویی را دور ریخته و پلیت مشاهده می­گردد.
۴- به پلیت مشاهده شده ته میکروتیوب، ۵۶۰ میکرولیتر بافرTE افزوده و چندبار به آرامی تکان داده می شود.
۵- ۳۰ میکرولیتر SDS 10% و همچنین ۳ میکرولیتر پروتئینازK mg/ml200 را به آن اضافه نموده که به غلظت نهایی g/mlµ۱۰۰ برسد و دوباره آن را خوب هم زده ودر حمام آب گرم به مدت ۱ ساعت در دمای ۳۷ درجه گذاشته و هر ۱۰ دقیقه یک بار هم زده می­­شود.
۶- ۱۰۰ میکرولیتراز NaCl 5 M به آن افزوده و دوباره به آرامی تکان داده می­ شود.
۷- ۸۰ میکرولیتر CTAB/NaCl به آن اضافه نموده و سپس به مدت ۵ دقیقه تکان داده و در حمام آبگرم ۶۵ درجه به مدت ۱۰ دقیقه قرار داده می­ شود.
۸- پس از خروج از حمام آبگرم ۷/۰ (کلروفرم : ایزوآمیل الکل به نسبت ۲۴:۱ ) به آن افزوده و خوب تکان داده و سپس سانتریفوژ به مدت ۵ دقیقه و rpm 10000 در دمای اتاق انجام می­ شود.
۹- بجای مرحله فنول مرحله کلروفرم را دوبار تکرار کرده و بار دوم هم حجم سوپرناتانت، کلروفرم : ایزوآمیل الکل اضافه گردید.
۱۰- بعد از سانتریفوژ ۳ فاز در میکروتیوب دیده می­ شودکه بایستی مایع رویی را به آرامی برداشته و به میکروتیوب جدید منتقل می­ شود.
۱۱- ۶/۰ حجم سوپرناتانت به آن ایزوپروپانول سرد افزوده و سپس چند دقیقه تکان داده و در فریزر۲۰- به مدت حداقل نیم ساعت نگهداری می­ شود.
۱۲- پس از خروج از فریزر آن را سانتریفوژ نموده ومایع رویی دور ریخته می­ شود.
۱۳- به پلیت شیری رنگ مشاهده شده ته میکروتیوب ، ۴۰۰میکرولیتر الکل ۷۰% اضافه نموده و سپس سانتریفوژ می­ شود.
۱۴- مایع رویی دور ریخته می­ شود و سپس تیوب ها را روی کاغذ صافی تمیز گذاشته شده تا کاملا خشک شوند.
۱۵- در مرحله آخر و پس از خشک شدن تیوب ها ، به هر تیوب۵۰ میکرو لیتر آب آمپولی یا ۲۰۰ میکرولیتر TE اضافه می­ شود. سپس چند دقیقه در دمای اتاق گذاشته که پلت در آن بخوبی حل شود و سپس به فریزر۲۰- منتقل می­کنیم و برای مرحله PCR مورد استفاده قرار می­گیرد.

 

روش استخراج DNA با کیت

 

 

 

    1. ۱۰۰۰ میکرولیتر بافر Gرا به ۲۰۰ میکرولیتر از نمونه باکتری رشدکرده اضافه می­کنیم سپس ۳/۰ گرم از zirconia 1/0 میلی متر به مخلوط اضافه شده و پس از ان به مدت ۵ دقیقه تیوب را ورتکس می­کنیم.

 

    1. ۲۰ دقیقه در دمای ۷۰ درجه انکوبه می­کنیم و هر پنج دقیقه یکبار تکان می­دهیم سپس ۵ دقیقه دور ۱۳۰۰۰ سانترفیوژ می­کنیم بعد فاز رویی را به یک تیوب جدید انتقال می­دهیم.

 

    1. ۳۰۰ میکرولیتر بافر G3 را به پلت مرحله­ قبل اضافه می­کنیم و بعد مرحله­۲ را تکرار می­کنیم و فاز رویی را به یک میکروتیوب جدید اضافه می­کنیم سپس هر دو تیوبی را که دارای فاز رویی می­باشند را به یک میکروتیوب جدید منتقل می­کنیم.

 

    1. نسبت ۱ به ۵ بافر G3 به سوپرناتانت مرحله­ قبل اضافه می­کنیم ۵ دقیقه روی یخ انکوبه می­کنیم سپس ده دقیقه ۱۳۰۰۰ دور سانتریفیوژ می­کنیم و بعد سوپرناتانت را به یک تیوب جدید اضافه می­کنیم و بعد به همان نسبت ایزوپروپانول اضافه می­کنیم تکان می­دهیم و روی یخ به مدت ۳۰ دقیقه انکوبه می­کنیم.

 

    1. ۱۵ دقیقه ۱۳۰۰۰ دور سانتریفیوژ می­کنیم و سوپرناتانت ها را دور می ریزیم و پلت ها را با ۱ میلی لیتر اتانول ۷۰ درصد شست و شو می­دهیم و سپس پلت را در ۲۰۰ میکرولیتر بافرDG1 حل می کنیم.

 

    1. ۲ میکرولیترRNase A را به تیوب اضافه می کنیم و در ۳۷ درجه برای ۱۵ دقیقه انکوبه می کنیم و سپس ۲۰ میکرولیتر پروتئینازK اضافه می کنیم هم می­زنیم و بعد ۲۰۰ میکرولیتر DG2 اضافه کرده و هم می زنیم.

 

    1. برای ۲۰ دقیقه در ۶۰ درجه انکوبه کرده و ۲۰۰ میکرولیتر اتانول به ان اضافه می کنیم و مدت زمان کمی هم می زنیم.

 

    1. محلول را به ستون اسپین موجود در کیت اضافه می کنیم.

 

    1. یک دقیقه ۱۰۰۰۰ دور سانتریفیوژ می کنیم و محتویات پایین ستون را دور می ریزیم.

 

    1. اضافه کردن ۵۰۰ میکرولیتر بافر DG3 به ستون و ۱۰۰۰۰ دور برای یک دقیقه سانتریفیوژ می کنیم و محتویات پایین ستون را دور می ریزیم.

 

    1. ۷۰۰ میکرولیتر بافرDG4 به ستون اضافه کرده و یک دقیقه با دور ۸۰۰۰ سانتریفیوژ می کنیم و محتویات پایین ستون را دور می ریزیم.

 

    1. سه دقیقه با دور ۱۳۰۰۰ سانتریفیوژ می کنیم ستون را برمیداریم و در یک تیوب ۵/۱ میلی لیتری جدید می گذاریم.

 

    1. ۱۰۰ میکرولیتر بافر DG5 به ستون اضافه کرده دو دقیقه در دمای اتاق قرار می دهیم و یک دقیقه با دور ۱۰۰۰۰ سانتریفیوژ می کنیم.

 

    1. محلول جمع شده در تیوب را دوباره به ستون اضافه می کنیم و دو دقیقه در دمای اتاق می گذاریم و دو دقیقه با دور ۱۳۰۰۰ سانتریفیوژ می کنیم.

 

  1. فاز زیری برمیداریم و در یخچال ۲۰- نگهداری می کنیم.

 

اندازه ­گیری کیفیت و غلظت DNA

 

بعد از تهیه DNA لازم است که کیفیت استخراج توسط ژل و طیف سنجی مورد بررسی قرار گیرد.
کنترل کیفیت و کمیت DNA به شرح زیر می­باشد.
الف) اندازه ­گیری غلظت DNA توسط اسپکتروفتومتری
برای تعیین کمیت و کیفیت DNA از دستگاه اسپکتوفتومتر استفاده می­ شود. در این دستگاه از دو طول موج ۲۶۰ و۲۸۰ نانومتر استفاده می‌شود. ظرفیت کوئت مورد استفاده ۵۰۰ میکرولیتر است. قبل از عمل اندازه‌گیری غلظت DNA باید دستگاه کالیبره شود. برای کالیبر دستگاه از ۵۰۰ میکرولیتر TE استفاده شد. این عمل به این نحو انجام ­شد که ابتدا کوئت سه بار با آب مقطر شستشو داده ­شد. سپس ۵۰۰ میکرولیتر TE به آن اضافه شده و در دستگاه قرار داده ­شد. با فشردن کلید کالیبرکردن، مقادیر ۲۶۰A و۲۸۰A روی صفر تنظیم شدند. در این آزمایش پس از کالیبرکردن، کوئت خالی شده و سپس به آن ۴۹۵ میکرولیتر TE اضافه ­شد. سپس ۵ میکرولیتر از نمونه‌های DNA که اخیراً (حدوداً ۲۴ ساعت قبل) استخراج شده‌اند و در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد بوده‌اند، به آن اضافه گردیدند. چنانچه مشخص است با این عمل غلظت DNA، ۴۲ بار رقیق‌تر می‌شود که بعداً برای محاسبه غلظت DNA اصلی باید آن را منظور کرد. پس از اضافه‌کردن DNA به کوئت آن را در دستگاه قرار داده و مقدار جذب ثبت گردید. بیشترین مقدار جذب امواج توسط DNA در طول موج ۲۶۰ نانومتر اتفاق می‌افتد. از طرفی مقدار بالای جذب در ۲۸۰ نانومتر نشانه وجود موادی غیر از DNA در نمونه است. بنابراین مقدار عددی جذب در ۲۶۰ نانومتر معیاری از غلظت DNA و نسبت عددی دو مقدار جذب در ۲۶۰ به ۲۸۰ معیاری از کیفیت آن است. در این آزمایش نمونه‌های DNA که دارای نسبت جذبی نزدیک به ۸/۱ هستند برای انجام آزمایش نگهداری شدند زیرا از کیفیت مناسبی برای PCR برخوردار هستند. برای تعیین غلظت DNA از فرمول ۵۰ × df × ۲۶۰ A =غلظت DNA (به نانوگرم در میکرولیتر) و ۵۰ × ۱۰۰ × ۲۶۰ A= غلظت DNA (به نانوگرم در میکرولیتر) استفاده گردید.
 

Add a Comment

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *